凝膠制備液相色譜儀是一種基于分子尺寸差異進行分離和純化的液相色譜技術(shù)。其核心在于利用多孔凝膠填料的立體排阻效應(yīng)，實現(xiàn)目標分子按流體力學(xué)體積大小的分離與收集，進而獲得高純度的組分。 一、技術(shù)原理
該技術(shù)的分離基礎(chǔ)是立體排阻效應(yīng)，也稱為尺寸排阻色譜。色譜柱內(nèi)填充的固定相是具有特定孔徑范圍的多孔凝膠顆粒。當含有不同尺寸分子的樣品溶液在流動相的帶動下流經(jīng)色譜柱時，分子在固定相孔道內(nèi)外發(fā)生擴散。尺寸較大的分子由于無法進入凝膠顆粒的孔道內(nèi)部，只能沿顆粒間的空隙流動，因此流經(jīng)的路徑較短，首先被洗脫出色譜柱。尺寸較小的分子則可以擴散進入凝膠顆粒的孔道內(nèi)部，流經(jīng)的路徑較長，因而被較晚洗脫。分子尺寸介于兩者之間的分子，則根據(jù)其進入孔道的難易程度和深度，在不同時間被洗脫，從而實現(xiàn)基于分子尺寸大小的分離。
此過程的分離度取決于凝膠填料的孔徑分布、色譜柱的柱效以及分子尺寸差異。該方法通常不涉及樣品分子與固定相之間的化學(xué)吸附作用，分離過程溫和，有利于保持生物大分子等活性物質(zhì)的天然構(gòu)象與活性。
二、工作流程
凝膠制備液相色譜儀的工作流程是一個系統(tǒng)化的操作序列，旨在將混合物中的目標組分按分子尺寸分離并收集。
1、系統(tǒng)準備與平衡。根據(jù)待分離樣品的分子量范圍，選擇具有相應(yīng)分離范圍的凝膠色譜柱。將選擇好的色譜柱安裝到儀器系統(tǒng)中，連接流路。設(shè)置合適的流動相流速和檢測器參數(shù)。使用選定的流動相沖洗系統(tǒng)，直至系統(tǒng)壓力、檢測器基線穩(wěn)定，完成色譜柱和系統(tǒng)的平衡。
2、樣品處理與進樣。將待分離的樣品溶解在流動相或與之相容的溶劑中。樣品溶液通常需經(jīng)過離心或過濾處理，以去除可能堵塞色譜柱的不溶性顆粒。使用進樣器將一定體積的樣品溶液精確地注入到流動相流路中。進樣后，樣品被流動相帶入色譜柱。
3、色譜分離與洗脫。在恒定的流動相流速下，樣品中各組分因尺寸不同而在色譜柱內(nèi)遷移的速率產(chǎn)生差異。隨著流動相的持續(xù)洗脫，不同大小的分子按從大到小的順序依次流出色譜柱。此過程通常在恒定的流動相組成下完成。
4、在線檢測與組分收集。從色譜柱流出的洗脫液立即流經(jīng)在線檢測器，檢測器產(chǎn)生與洗脫液組分濃度相關(guān)的信號，形成隨時間變化的色譜圖。操作人員根據(jù)色譜圖顯示的峰形和出峰時間，設(shè)定收集參數(shù)。當目標組分對應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)時，餾分收集器被觸發(fā)，自動將含有目標組分的洗脫液收集到指定的容器中。對于多組分分離，可依據(jù)色譜圖依次收集不同分子量范圍的餾分。
5、系統(tǒng)清洗與維護。分離收集任務(wù)完成后，使用適當?shù)那逑匆簺_洗色譜柱及整個流路，以去除殘留的樣品成分。隨后，根據(jù)色譜柱的保存要求，將其儲存于合適的溶劑中，以備下次使用。
整個過程依賴于穩(wěn)定的泵送系統(tǒng)輸送流動相，色譜柱提供分離場所，檢測器實時監(jiān)測分離效果，以及收集器精確捕獲目標餾分。通過優(yōu)化色譜柱選擇、流動相條件和操作參數(shù)，可以實現(xiàn)對不同分子量范圍樣品的高效制備純化。
